Deficience homologní rekombinace u ovariálního karcinomu a testování HRD

Přibližně 50 procent žen s epiteliálním karcinomem vaječníků (EOC) vykazuje deficit homologní rekombinace (HRD). HRD popisuje fenotyp buňky, která má při opravě dvouřetězcových zlomů narušenou schopnost homologní rekombinace (HRR). Při absenci této dráhy se uplatňuje méně fidelitní, k chybám náchylný opravný proces nehomologního spojování volných konců (NHEJ). Tento mechanismus vede ke genomické instabilitě a buněčné smrti nádorové buňky. Jedním ze způsobů, jak podpořit aktivitu NHEJ v buňkách HRD je zvýšit počet dvouřetězcových zlomů pomocí inhibitorů PARP. Nádory lze testovat na HRD pomocí testů genomické instability, které zahrnují HRD způsobenou mutacemi genů dráhy HRR (např. mutace BRCA1/2), epigenetickými změnami nebo neznámými příčinami. U pokročilého karcinomu vaječníků může testování genomické instability identifikovat přibližně o 19 procent více žen s tumory HRD než panelové testy HRR.

Ovariální karcinomy řadíme mezi gynekologické malignity, které dlouhodobě zaujímají první místo v mortalitě gynekologických nádorů. Celosvětově se udává, že přibližně 75 procent pacientek je diagnostikováno s pokročilým stadiem onemocnění (stupeň III až IV), a mezi těmito pacientkami činí pětiletá míra přežití přibližně 30 procent.¹

Přibližně 50 procent epiteliálních karcinomů vaječníků vykazuje defektní DNA homologní rekombinaci v důsledku genetických a epigenetických změn genů této dráhy. Defektní HR dráha je u EOC důležitým terapeutickým cílem, to dokládá účinnost jak analogů platiny u tohoto onemocnění, tak nástup inhibitorů PARP, které fungují v tomto případě (defektní HR) na principu syntetické letality.²

Definice testů HRD a metody detekce HRD u HGSOC

S ohledem na nové léčebné režimy vyplývá, že pouze testování BRCA k celkovému záchytu pacientek profitujících z léčby PARPi není dostačující. V současné době jsou testy HRD stále ještě „mimo“ rutinní klinické použití a testovací „rate“ je nízký. Napomáhá tomu také dlouhý TAT (čas do výsledku), centralizované testování a vysoká cena.³

K identifikaci HRD u pacientek lze přistupovat dvojím způsobem. Buď sledujeme příčinu HRD a hledáme přítomnost konkrétních mutací genů BRCA1/2 a dalších genů HRR pomocí panelového testování. Ale do správné exprese genů HRR zasahují také jiné buněčné mechanismy, jako např. metylace promotoru či epigenetické změny, které nemohou být pomocí současných panelů HRR detekovány. Tímto způsobem určíme sice genotyp genetických mutací způsobující HRD, ale tento přístup nevede k identifikaci stejné populace pacientek jako tzv. scar testy. Nevýhodami tohoto přístupu jsou také např. nejasnosti, které mutace v dráze HRR způsobují HRD. V tomto případě by jako podklad pro léčbu měla sloužit pouze detekce mutací genů BRCA1/2. Ostatní geny HRR jsou vzácné a je těžké jim přiřadit klinický význam.

Druhým, komplexnějším přístupem není hledání příčiny, ale důsledku HRD. Pomocí instabilitních testů hledáme přítomnost jakýchkoli chromozomálních či genetických změn, které vedou ke ztrátě funkce HRR. Tím určíme fenotyp genomické instability, vedoucí k HRD.⁴

HRR panelové testování

Testy mutací genů BRCA (zárodečných, nádorových) vykazují dobrou klinickou validitu díky důsledné identifikaci podskupin pacientek s ovariálním karcinomem, které nejvíce profitují z léčby PARPi. V současné době ale není pro predikci odpovědi na PARPi k dispozici dostatečné množství důkazů pro určení klinické validity ostatních genů HRR dráhy (mimo BRCA). Vzhledem k relativně vzácnému výskytu mutací těchto genů (často spadají do třídy VUS – variant nejasného významu) se klinická interpretace ve vztahu k predikci léčby stává složitou.³ V současné době také neexistují dostatečné důkazy k určení klinické validity v případě metylace promotoru BRCA1 nebo RAD51C pro předpověď přínosu PARPi. Klinický význam metylace je obtížně interpretovatelný. Je sice prokázáno, že biologická evidence metylace promotoru (snížená exprese genů) BRCA1 a RAD51C může vést k HRD, nicméně klinické studie mají nejednotné důkazy přesnosti a spolehlivosti tohoto biomarkeru predikce PARPi u HGSOC.³

Funkční assaye

Nejčastěji používaným experimentálním systémem pro stanovení HRR bylo stanovení množství proteinu RAD51 v jádře. Snížená koncentrace RAD51 v jádře je asociována s defekty genů BRCA1/2, stejně jako s odpovědí na PARPi.^3,5,6

Funkční testy HRD určují aktuální stav HR pomocí (ne)schopnosti akumulovat protein RAD51 v místech poškození DNA.⁷ Funkční test RECAP (REcombination CAPacity) určuje kapacitu proliferujících nádorových buněk akumulovat protein RAD51 v místech dvouřetězcových DNA zlomů (indukovaných ionizujícím zářením) pomocí koimunofluorescenčního barvení (co‑IF) pro RAD51 a geminin (GMN) marker pro G2/S fázi, ve které se uplatňuje HRR. Logistickou limitací těchto testů jsou však požadavky na čerstvé vzorky nádorů a ex vivo indukce poškození DNA, což komplikuje použití testů RECAP v klinickém provozu.^7,8,9

Dle doporučení ESMO ale v současné době neexistují dostatečné důkazy pro zjištění klinické validity funkčních testů pro predikci odpovědi k terapiím PARPi. Tyto preklinické testy ale poskytují příslib pro testování HRD do budoucna.³

Scar assaye

Většina současných testů detekujících HRD byla vyvíjena na základě technologií SNP‑based microarray a detekují somatické CNV (copy number variation – variace v počtu kopií). Assaye predikují genomickou instabilitu na základě kvantifikace velkých genomových přestaveb LST (large scale transitions), ztráty heterozygozity LOH (loss of heterozygosity) a subchromozomálních telomerických alelických imbalancí TAI (telomeric allelic imbalance).

Kromě komerčně dostupných služeb se do popředí zájmu dostávají nově vyvíjené alternativní testy HRD, obsahující většinou dvě složky: status genomické instability (zahrnující TAI, LST a LOH), vyžadující většinou pokrytí pangenomovými SNP sondami. Pro určení pozitivního nebo negativního výsledku se použije validovaný, experimentálně ověřený cut‑off. Druhou složkou je poté samotná sekvenční analýza buď pouze genů BRCA1 a BRCA2, nebo častěji identifikace širšího panelu genů HRR. Kombinace těchto výsledků tvoří celkovou intepretaci – pozitivní stav HRD je definován buď přítomností patogenní/pravděpodobně patogenní varianty v genech BRCA1/2 nebo jiných genech HRR, a/nebo pozitivním statusem genomické instability, tzn. například i pacientky bez mutace BRCA mohou být HRD+.

Evropský konsensus týkající se testování HRD

Cílem tohoto projektu je vytvoření celoevropského konsensu pro genetické testování, rozhodování a klinický management pacientek s nově diagnostikovaným pokročilým OC a určení validity HRD biomarkeru pro predikci účinnosti PARPi v 1L.

Tato kolaborující skupina 27 evropských zemí sestává z řídícího výboru (14 členů) a účastníků řady specializací: onkologové, genetici, patologové aj. (84 členů). K vytvoření konsensuálních prohlášení na základě systematických rešerší byl použit (modifikovaný) proces Delphi dle doporučení PRISMA (Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta‑Analyses). Konkrétní témata k řešení se týkala testování BRCA po určení diagnózy OC, testování genů HRD, HRR mimo BRCA, mutace v genech MMR u OC, implementace genetického testování do klinické praxe. Zásadní konsensuální prohlášení vyplývající z tohoto projektu jsou následující:¹⁰

• Současné směrnice ESMO doporučují zvážit k identifikaci pacientek profitujících z PARPi testování HRD.³
• Testy „myChoice CDx“ a „FoundationFocus CDx BRCA LOH“ nejsou vzájemně nahraditelné.¹⁰
• Mutace HRR v 1L nejsou považovány za prediktivní z hlediska HRD nebo citlivosti k PARPi.^11,12
• Optimální je simultánní testování BRCA a HRD, pokud je tato možnost k dispozici.
• Testování HRD z nádoru by mělo být provedeno v čase primární diagnózy.
• Testování HRD by mělo být provedeno u všech epiteliálních nádorů, převážně high‑grade nemucinózních.
• Testování HRD by mělo být provedeno buď po testování BRCA, ale nejlépe společně s testováním BRCA před ukončením 1L chemoterapie.
• Je potřeba vývoje nových, alternativních, validovaných testů HRD.
• Klinicky ověřené testy HRD jsou důležité pro hodnocení statusu HRD před ukončením 1L chemoterapie.
• Status germinální nebo somatické mutace BRCA, v případě BRCA wt pak také HRD status, by měl být stanoven po primární diagnóze a ideálně před koncem 1L chemoterapie.¹⁰

Závěr

Bez ohledu na komerční dostupnost jednotlivých testovacích souprav v roce 2022 je stále nezbytně nutné zkoumat predikující odpověď na léčbu PARPi. Je potřeba přímé srovnání se studijním referenčním testem a srovnání referenčních vzorků zohledňujících odpověď PARPi a genomické skóre. Genomická instabilita je kontinuální veličina, je nutné na ni aplikovat definovaný, důkladně experimentálně podložený cut‑off. Ztráta heterozygozity se dá snadno posoudit pomocí WGS s nízkým pokrytím. Je ale zatím nejasné, zda je samotné LOH dostatečné pro určení HRD. Současným přetrvávajícím doporučením je zahrnout také TAI a LST.¹³

Jak by tedy měl vypadat ideální akademický test HRD? Ideální kritéria jsou: spolehlivý, snadno implementovatelný, univerzálně použitelný, s rychlým časem odezvy a nízkou cenou. V současné době probíhá několik průběžných validačních studií alternativních (dodatečných) testů HRD buď v rámci farmaceutických firem, akademických konsorcii, jednotlivých laboratoří a diagnostických společností. Srovnání využívá rozličné metodologie a statistické analýzy. Konečný výběr testu HRD v konkrétní klinické laboratoři budou kromě citlivosti/specificity pravděpodobně ovlivňovat další parametry testu, jako je technologická platforma, doba odezvy, cena a kompatibilita se stávajícími laboratorními pracovními postupy.

Autorka je zaměstnancem společnosti AstraZeneca Czech Republic s. r. o.

CZ‑3075

Literatura

1. Chetrit A et al. Effect of BRCA1/2 mutations on long‑term survival of patients with invasive ovarian cancer: the national Israeli study of ovarian cancer. J Clin Oncol. 2008 Jan 1;26(1):20–25.
2. Konstantinopoulos PA, Ceccaldi R, Shapiro GI et al. Homologous Recombination Deficiency: Exploiting the Fundamental Vulnerability of Ovarian Cancer. Cancer Discov. 2015 Nov;5(11):1137–1154.
3. Miller RE et al. ESMO recommendations on predictive biomarker testing for homologous recombination deficiency and PARP inhibitor benefit in ovarian cancer. Ann Oncol. 2020 Dec;31(12):1606–1622.
4. Hoppe MM, Sundar R, Tan DSP et al. Biomarkers for Homologous Recombination Deficiency in Cancer. J Natl Cancer Inst. 2018 Jul 1;110(7):704–713.
5. Mukhopadhyay A et al. Clinicopathological fea­tu­res of homologous recombination‑deficient epithelial ovarian cancers: sensitivity to PARP inhibitors, platinum, and survival. Cancer Res. 2012 Nov 15;72(22):5675–5682.
6. Hill SJ et al. Prediction of DNA Repair Inhibitor Response in Short‑Term Patient‑Derived Ovarian Cancer Organoids. Cancer Discov. 2018 Nov;8(11):1404–1421.
7. van Wijk LM et al. The RECAP Test Rapidly and Reliably Identifies Homologous Recombination‑Deficient Ovarian Carcinomas. Cancers (Basel). 2020 Sep 29;12(10):2805.
8. de Jonge MM et al. Frequent Homologous Recombination Deficiency in High‑grade Endometrial Carcinomas. Clin Cancer Res. 2019 Feb 1;25(3):1087–1097.
9. Meijer TG et al. Functional Ex Vivo Assay Reveals Homologous Recombination Deficiency in Breast Cancer Beyond BRCA Gene Defects. Clin Cancer Res. 2018 Dec 15;24(24):6277–6287.
10. Vergote I et al. European experts consensus: BRCA/homologous recombination deficiency testing in first‑line ovarian cancer. Ann Oncol. 2022 Mar;33(3):276–287.
11. Swisher EM et al. Rucaparib in relapsed, platinum‑sensitive high‑grade ovarian carcinoma (ARIEL2 Part 1): an international, multicentre, open‑label, phase 2 trial. Lancet Oncol. 2017 Jan;18(1):75–87.
12. Kristeleit R. ARIEL2: Genetic analysis of the tumour prospectively identifies patients with ovarian cancer most likely to respond to rucaparib (abstract 2700). ECC‑ESMO. Vienna, Austria. 2015.
13. Jenner ZB, Sood AK, Coleman RL. Evaluation of rucaparib and companion diagnostics in the PARP inhibitor landscape for recurrent ovarian cancer therapy. Future Oncol. 2016 Jun;12(12):1439–1456.