Genomické testování personalizuje léčbu karcinomu prsu

Genomické testování je jedním z klíčových nástrojů personalizovaného managementu zhoubných nádorů. Příkladem onemocnění, v jehož léčbě se již plně uplatňuje v reálné klinické praxi, je časně diagnostikovaný nádor prsu. Prognostický molekulární test MammaPrint analyzuje z histologického vzorku celkem 70 genů, jeho výsledkem je stratifikace rizika vzniku metastáz. „Zatímco pacientky s vysokým rizikem profitují z adjuvantní chemoterapie, ty, které jsou vyhodnoceny jako nízkorizikové, mohou být adjuvantní léčby bezpečně ušetřeny. MammaPrint je pro české pacientky dostupný už delší dobu, relativně nově ale není třeba vzorky zasílat do zahraničí a testování probíhá přímo na našem území. Oddělení onkologické patologie Masarykova onkologického ústavu (MOÚ) totiž získalo jako teprve čtvrtá laboratoř v Evropě certifikaci společnosti Agendia NV, výrobce testu MammaPrint. Nyní máme k dispozici už více než roční lokální zkušenost,“ uvedla vedoucí laboratoře molekulární patologie MOÚ Mgr. Jitka Berkovcová, Ph.D.

MammaPrint sleduje expresi celkem 70 genů, ty popisují šest získaných vlastností nádorových buněk (hallmarks of cancer – únik apoptóze, přetrvávající angiogenezi, neomezený replikační potenciál, invazi tkání a tvorbu vzdálených metastáz, nezávislost v rámci růstové signalizace, netečnost k omezení růstu). Mezi klíčové geny, které řídí proteinové interakce, patří zejména TP53, RB1, MYC, JUN a CDKN2A. Výsledkem testu je MP skóre, jeho kladná hodnota představuje nízké riziko recidivy nebo vzniku metastáz v období do deseti let od diagnózy, záporná hodnota riziko vysoké. V rozmezí hodnoty MP skóre –0,0575 až +0,0575 je přesnost klasifikace o něco slabší, správné určení klesá pod 90% hranici. To se ale reálně týká malého množství testovaných, management je v takovém případě individualizovaný. Test MammaPrint využívá technologii sekvenování nové generace s cílovým obohacením pro hodnocení genové exprese na vzorcích tkáně fixované ve formaldehydu. Data jsou analyzována nástrojem ADAPT (Agendia Data Analysis Pipeline Tool). Skóre MP predikuje pravděpodobné biologické chování nádoru nad rámec dosud používaných znaků, jako je konvenční grading, míra postižení lymfatických uzlin nebo další parametry. Pacientkám, které jsou vyhodnoceny jako nízce rizikové, může genomické testování přinést výrazně vyšší kvalitu života při léčbě tím, že nemusejí absolvovat adjuvantní chemoterapii se všemi nežádoucími účinky z toho vyplývajícími. Dosavadní zkušenost totiž ukazuje, že chemoterapie má přínos především u agresivních typů nádorů, ve kterých ničí dělící se buňky. Pokud jich v nádoru není dostatečné množství, je chemoterapie neefektivní, nádor se nezmenšuje a léčba pacientku spíše zatěžuje.

Testování pomocí MammaPrint prospektivně sledovala randomizovaná klinická studie III. fáze MINDACT, která byla uveřejněna v New England Journal of Medicine v roce 2016. Celkem 6 693 žen s časným karcinomem prsu podstoupilo testování genomického rizika pomocí MammaPrint, u všech pacientek bylo určeno rovněž modifikované skóre klinického rizika Adjuvant! Online, stanovené pomocí dosud užívaných charakteristik. U žen v nízkém klinickém i genomickém riziku nebyla adjuvantní chemoterapie použita, léčeny byly jen hormonálně. Analogicky pacientky ve vysokém genomickém i klinickém riziku byly adjuvantní chemoterapií léčeny vždy. V případě rozporu byly nemocné randomizovány ke stratifikaci rizika buď dle klinického, nebo genomického skóre. Primárním cílem studie bylo vyhodnocení parametru přežívání bez známek vzdálené recidivy (DMFS) po pěti letech. V případě vysokého klinického a nízkého genomického rizika (n = 1 550) byla četnost recidiv shodná bez ohledu na podání adjuvantní chemoterapie (DMFS 96,5 % vs. 94,7 %; 95% interval spolehlivosti [CI] 0,6–1,06; p = 0,08). Relevantní posouzení u pacientek s nízkým klinickým a vysokým genomickým rizikem nebylo možné, tato skupina byla příliš malá. Závěrem studie bylo, že pacientky s klinicky vysokým, ale genomicky nízkým rizikem lze bezpečně ušetřit adjuvantní chemoterapie, takových nemocných je mezi klinicky vysoce rizikovými 46 procent. To přináší nejenom zdravotní a psychologický benefit, ale také finanční a systémové úspory.

Pro koho je test určen

MammaPrint je určen pro pacientky všech věkových skupin s lokalizovaným, hormonálně pozitivním a HER2 negativním nádorem prsu o velikosti do 5 cm, respektive s nízkým počtem (maximálně tří) blízkých metastáz do uzlin. U všech pacientek, u kterých vyšetření indikuje multidisciplinární tým v komplexním onkologickém centru (KOC), je hrazen z veřejného zdravotního pojištění, a to jednou za život pro každý prs. Doporučit nemocnou k posouzení ale může každý ošetřující onkolog. Použití testu k rozhodnutí o způsobu léčby je podpořeno aktualizací doporučených postupů v tzv. Modré knize a je v souladu s evropskými doporučenými postupy v oblasti genomického testování v kategorii 1A. Vzorek pro test pochází z patologicky zpracovaného resekátu nádoru. Optimální je, pokud se vzorek dostane k patologovi časně po odběru, aby mohl upravit podmínky fixace. Tkáň potom musí být správně fixována po správnou dobu a zpracována do parafínových bloků, primární zpracování se nicméně nijak neodchyluje od běžných standardů. Odesílající patolog nejprve v běžném hematoxylin‑eozinovém barvení posoudí vzorky a vybere tkáň s minimálně 30% zastoupením nádorových buněk, z prořezávek by měl zvolit reprezentativní část. „Naše laboratoř následně provádí ze čtyř až osmi řezů o síle 5 µm izolaci RNA nádoru. Test MammaPrint se totiž provádí z RNA, což představuje technickou výzvu. Práce s ní je velmi náročná, RNA rychle a snadno degraduje a ribonukleázy jsou všudypřítomné. Z výchozího množství 200 ng RNA se pomocí řady precizních metod včetně fragmentace, reverzní transkripce, amplifikace a několika kontrolních kroků připraví knihovna, následuje hybridizace a sekvenování na MiSeq, trvající 16 hodin (150 cyklů + 8 cyklů indexu). Ačkoli zpracování probíhá plně v naší laboratoři, vlastní analýza dat je prováděna centrálně na cloudu společnosti Agendia a po odeslání sekvenačních dat je výsledek ve formátu PDF k dispozici asi do dvou hodin od nahrání,“ popsala Mgr. Berkovcová.

Certifikace laboratoře – roční proces

Genomické testování je složité a vyžaduje komplikované a přesně stanovené laboratorní postupy a splnění požadovaných norem. Celý proces po obdržení patologického vzorku trvá podle Mgr. Berkovcové asi čtyři dny: „První den probíhá izolace RNA, další dva dny se připravuje knihovna a přes noc běží sekvenace. Čtvrtý den je výsledek k dispozici. Reálně ale může být pro konkrétního pacienta proces o něco delší, protože vzorky zpracováváme hromadně. Zpracování se tak zatím zahajuje jen jednou týdně. To je rozdíl oproti dosavadnímu odesílání do centrální laboratoře v USA. Tam sice nějakou dobu trval transport, jejich pracoviště ale zahajovalo celý cyklus denně. Jedná se ale o laboratoř s úplně jinou filosofií – během certifikace nás navštívila její zástupkyně a školila nás v procesu, zároveň ale byla překvapena, kolik metod u nás rutinně ovládáme. Zatímco jejich laboratoř se věnuje jen této metodě, u nás probíhá komplexní molekulárněpatologická diagnostika v celé své běžné šíři.“

O průběhu certifikace hovořila Mgr. Berkovcová podrobněji. Jednalo se asi o roční proces, během kterého musela laboratoř doložit svou velmi vysokou kompetenci. Zakončením bylo paralelní zpracování deseti shodných vzorků v centrální laboratoři v Irvine v Kalifornii a v MOÚ, výsledky se musely shodovat ve 100 procentech případů. I po udělení certifikace je třeba udržovat vysokou úroveň kvality, paralelní testování deseti vzorků se každoročně opakuje. Test MammaPrint nyní v MOÚ provádějí rutinně. „Od března 2023 provedla naše laboratoř testování MammaPrint u 397 osob, z toho dvou mužů, u dvou pacientek se jednalo o oboustranný karcinom. Celkem 213 z nich bylo vyhodnoceno jako high­‑risk, 155 jako low‑risk a 23 jako ultra low‑risk. Hodnoty blízké nule, které vykazují nižší prognostickou přesnost, byly odhaleny u 57 z celkem 397 měření, teda asi v sedmi procentech souboru. Do budoucna očekáváme rozšíření naší kapacity, a tím i větší dostupnost testu, již nyní vyšetřujeme vzorky z celé republiky a ze Slovenska.“

Příbuzným testem k MammaPrint je test BluePrint, který rovněž představuje genomické testování na základě zpracování RNA nádoru. Provedení testu BluePrint posiluje vypovídací hodnotu MammaPrintu a lze ho provést ze stejného vzorku. Výsledkem BluePrint je především stanovení typu onemocnění. BluePrint rozřazuje nádory na luminální, bazální a HER2 pozitivní, indikován ale je jen u pacientek, které jsou už v základu HER2 negativní na základě běžných imunohistochemických metod. „Skutečně během testování na našem pracovišti od března 2023 se žádný HER2 pozitivní nádor nevyskytl. 178 pacientek bylo vyhodnoceno jako nízce rizikový luminální typ A, 212 jako vysoce rizikový luminální typ B a bazální typ byl odhalen u jedné pacientky. Jiným, v klinické praxi používaným testem je Oncotype DX, jehož vyšetření se provádí v USA a vzorky je třeba zaslat. Ten vyšetřuje RNA metodou RT qPCR (reverzní transkripce a kvantitativní PCR) a sleduje expresi celkem 16 genů, normalizovaných k pěti housekeepingovým genům,“ dodala Mgr. Berkovcová.