Imunologie sepse

Sepse představuje systémovou zánětlivou reakci organismu na infekci. Etiologicky se u septických stavů uplatňují bakteriální, virová, mykotická i parazitární agens. U gramnegativní infekce je základní strukturou patogenity endotoxin, resp. lipid A (Braude AE, 1963). Plazmatická koncentrace endotoxinu koreluje s rozvojem syndromu multiorgánové dysfunkce MODS a letalitou. Endotoxémie může být přítomna i při neprokázané gramnegativní bakteriémii, stejně jako u pacientů s grampozitivní infekcí. Příčinou je bakteriální translokace, při níž dochází k prostupu mikrobů a jejich produktů přes slizniční bariéru (Feltis BA et al., 1994). Většina patogenetických účinků u grampozitivních bakterií je výsledkem působení exotoxinů. Příkladem je syndrom toxického šoku způsobený toxinem 1, který produkuje Staphylococcus aureus. Účinkem výše zmíněných bakteriálních struktur na leukocyty a buňky parenchymatózních orgánů dochází k produkci prozánětlivých cytokinů. Dva hlavní – tumor nekrotizující faktor alfa (TNFα) a interleukin 1b (IL-1β) – jsou důležité v rozvinutí zánětlivé kaskády indukované endotoxinem (Dinarello CA, 1991). Tyto cytokiny stimulují imunitní odpověď, která mimo jiné zahrnuje jejich uvolnění, aktivizaci metabolismu kyseliny arachidonové, expresi integrinů, aktivaci komplementu nebo produkci oxidu dusnatého. Grampozitivní, gramnegativní bakterie a další patogeny disponují molekulárními strukturami, které jsou hlavními „terči“ při rozpoznání systémem vrozené imunity. Dané molekuly označujeme jako „s patogenem asociované molekulární vzory“ (pathogen-associated molecular patterns, PAMP) (Medzhitov R, 1997). V systému vrozené imunity se při jejich rozpoznání uplatňují makrofágy a dendritické buňky (DB), které je pak předkládají T lymfocytům. Oba typy buněk prezentujících antigen disponují receptory rozpoznávání (pattern recognition receptors, PRR), jež se na dané struktury vážou. Patří mezi ně kolektiny, receptor CD14, receptory toll-like (TLR), protein vázající manózu, sérový amyloid P, receptory pro komplement, C reaktivní protein, Fc receptory, CD11b,c/CD18 a DEC 205. Důsledkem uvedených vazeb je přenos signálu prostřednictvím „protein myeloid differentiation factor 88“ (MYD88) a „nuclear factor kB“ (NFkB) do nitra hostitelské buňky, což vede k transkripci genů pro produkci cytokinů IL-1 a IL-12, TNFa a B7 (Hemmi H, 2000; Ozinsky A, 2000; Wiel E, 2002), viz obr. 1.

Cytokiny produkované u septických pacientů aktivují jejich koagulační systém. Klíčovou roli má v koagulační kaskádě tkáňový faktor (TF), který je aktivován TNFα, IL-2 a IL-6. Působení cytokinů vede k redukci fibrinolýzy, poklesu proteinu C a antitrombinu III. Aktivovaný protein C inhibuje faktory Va, VIIa a inhibitor aktivátoru plasminogenu (PAI1). Antitrombin III inhibuje extrinsické koagulační faktory Xa, XIa, IIa a plasmin. Progredující prokoagulační stav akcentuje zánětlivou odpověď při sepsi. Významnou roli v další progresi má dysfunkce endotelu. Působením TNFa, IL-1 a dalších prozánětlivých mediátorů dochází k významné dysfunkci endotelu společně se změnou fenotypu na protrombotický. Důsledkem je tvorba mikrovaskulárních trombů a ischémie. Je narušena mikrocirkulace se zvýšenou permeabilitou, s progredující vasodilatací, orgánovou dysfunkcí a šokem.

Zánět – hlavní patogenetický mechanismus sepse

U pacientů se sepsí je hlavním patogenetickým mechanismem zánět. Ten představuje fyziologický kompenzační mechanismus, který spojuje systém vrozené a získané imunity. Jeho primární úlohou je zachování homeostázy a odstranění insultů, které ji narušují. Patogeneze sepse je spojena s poruchou imunitních funkcí na úrovni humorální imunity a rovněž imunity zprostředkované buňkami.

Imunitní odpověď pacientů se sepsí je charakterizována buď hyperzánětlivou systémovou reakcí, nebo naopak „imunoparalýzou“ s nízkou expresí antigenu HLA-DR na monocytech a sníženou produkcí TNFα ex vivo po stimulaci lipopolysacharidem (Průcha M, 2003), viz obr. 2. Hyperzánětlivou fázi charakterizuje vysoká produkce cytokinů – TNFα, faktoru inhibujícího migraci (MIF) a „high-mobility group box I“ (HMGBI) proteinu (Calandra, 2000; Wang, 1999). Obě fáze se vyskytují nezávisle na sobě a v různých časových okamžicích při rozvoji sepse. Důležitou roli v procesu navození „imunoparalýzy“ hraje IL-10, který suprimuje expresi znaků proteinu MHC II. třídy a touto cestou inhibuje antigen specifickou proliferaci T lymfocytů (Oberholzer, 2002). V systému buněčné imunity se aktivované CD4+ T lymfocyty dělí na dvě podskupiny s antagonistickým profilem produkovaných cytokinů. První je Th1 produkující zejména prozánětlivé TNFa, interferon gama (IFNγ) a interleukin 2, které zvyšují schopnost fagocytů zabíjet infekční agens. Druhou je Th2 s produkcí protizánětlivých IL-4 a IL-10, které naopak podporují zejména humorální odpověď proti extracelulárním patogenům.

Přesmyk prozánětlivé odpovědi do protizánětlivé, apoptózou navozená ztráta CD4+ buněk, B buněk a dendritických buněk, dále snížená exprese molekul MHC II. třídy a imunosupresivní efekt apoptotických buněk jsou mechanismy zodpovědné za imunosupresi u sepse.

Apoptóza v procesu sepse

Apoptóza, neboli programovaná smrt buňky, je podobně jako u zánětu procesem primárně fyziologickým, jehož úkolem je zachování homeostázy a remodelace tkání, a aktivním procesem imunitní odpovědi na exo- a endogenní podněty. U sepse byla prokázána zvýšená apoptóza imunokompetentních buněk, která ve svém důsledku působí imunosupresivně (Ayla, 2003; Chung, 2000; Hotchkiss, 1999a). Největší počet apoptotických buněk byl nalezen ve slezině a střevu (Hotchkiss, 1999b). Pokles imunokompetentních buněk má pochopitelně odezvu ve snížené schopnosti organismu reagovat na infekci. Apoptotické buňky navíc aktivně potlačují zánětlivou odpověď (Vol 1997).

Dosud nezodpovězenou otázkou zůstává význam apoptózy pro klinický výsledek sepse. Zatímco byla prokázána závislost na počtu lymfocytů, kauzalita mezi zvýšenou apoptózou lymfocytů a letalitou pacientů se sepsí prokázána nebyla. V současné době se diskutuje o možném terapeutickém přístupu s využitím signálních molekul pro apoptózu jako cíle pro léčbu sepse (Wesche–Soldato DE, 2007).

Parametry charakterizující přítomnost infekce

C reaktivní protein

V roce 1930 byl u pacientů s pneumokokovou pneumonií objeven Tillletem a Francisem  archetyp proteinu akutní fáze – tzv. C reaktivní protein (CRP). Ten váže grampozitivní i gramnegativní bakterie, stimuluje jejich adhezi a fagocytózu leukocytů závislou na komplementu. Souhrnně se dá říci, že hlavní funkcí CRP je vazba cizorodých struktur endo- i exogenního původu (alterovaných membrán, buněčné debris, bakterií, parazitů), která startuje obranné mechanismy makroorganismu – adherenci a modulaci fagocytujících buněk, aktivaci komplementového systému, stimulaci opsonizace a fagocytózy. Uvedené poznatky se využívají v diagnostice pacientů na jednotkách intenzivní péče (Clayes, 2002; Kragsbjerg, 1995; Pettila, 2002).

Prokalcitonin

Prokalcitonin (PCT) – protein o sekvenci 116 aminokyselin – je prohormonem kalcitoninu. Za fyziologických podmínek je kalcitonin secernován C buňkami štítné žlázy, kde je tvořen právě ze svého prekursoru – prokalcitoninu. Hlavními producenty PCT jsou makrofágy a monocytární buňky různých orgánů, zejména jater (Bracq, Machason, 1993). Po injekci bakteriálního endotoxinu je syntéza PCT v plazmě zjistitelná již po dvou až třech hodinách. Maximální koncentrace dosahuje po šesti až dvanácti hodinách. Biologický poločas PCT je 20 až 24 hodin. Koncentrace indukovaného PCT u sepse kolísá v rozmezí desítek až stovek ng/ml. Induktorem produkce PCT mohou být bakteriální exo- a endotoxiny, stejně jako některé cytokiny (Bensousan, 1997; Dandova, 1994; Whang, 1999). Zvýšená koncentrace PCT je přítomna i v jiných klinických situacích, ale není tak významná, jako je tomu v případě sepse. Výjimku tvoří pacienti po transplantaci jater, u nichž dochází v časném pooperačním období k významné elevaci PCT bez přítomnosti infekce (Zazula et al., 2007). U pacientů se systémovým bakteriálním zánětem má PCT lepší senzitivitu a specificitu v porovnání s CRP (Simon L, 2004).

Protein vázající lipopolysacharid

Jedná se o protein molekulární hmotnosti 58 kDa produkovaný při akutní zánětlivé odpovědi játry. Za fyziologických podmínek jeho role spočívá v umožnění vazby lipidu A nebo bakteriálního lipopolysacharidu (LBP) na molekulu CD14, která je přítomna na monocytárních buňkách a makrofázích. Koncentrace LBP v séru za fyziologických podmínek kolísá mezi 5 až 15 ng/ml a během odpovědi akutní fáze se několikanásobně zvyšuje. Ve vztahu k sepsi se nepotvrdila jeho pozitivní prediktivní hodnota pro rozlišení systémové zánětové odpovědi organismu (SIRS) infekční a neinfekční etiologie (Průcha M, 2003). Rovněž není schopen stratifikovat tíži sepse (Blairon, 2003).

Cytokiny IL-6, IL-8, IL-10

Jejich role jako diagnostických parametrů byla opakovaně zkoumána v mnoha klinických studiích. Obecně lze generalizovat, že jejich koncentrace jsou odrazem závažnosti infekčního procesu (Oberholzer, 2003).

CD64

Vysokoafinitní receptor pro Fc fragment imunoglobulinu G je exprimován na monocytech a makrofázích. Na granulocytech zdravých osob je exprese zanedbatelná, ale ke zvýšení dochází u bakteriálních infekcí, např. u pneumonie, infekcí močových cest, erysipelu, peritoneálního abscesu, sepse či septického šoku. Je dalším z parametrů umožňujících rozlišení infekční a neinfekční etiologie SIRS (Cardelli P, 2008; Sedláčková L, 2005).

Detekce extrahumánního genomu

Studie prokázaly, že 20 až 35 procent antibiotické empirické terapie je nasazeno nesprávně, což má přímý negativní důsledek pro prognózu pacienta (Ibrahim EH, 2000; Kollef MH, 2003). Cílem je tedy urychlení diagnostiky infekce – resp. infekčního agens. K dispozici jsou komerčně dostupné soupravy, např. SeptiFast (PCR Real Time), PNA-FISH (peptide nucleic acid fluorescence in situ hybridization) nebo použití detekce univerzální 16S rRNA s možností následné sekvenace pozitivního produktu. Výsledkem je přesná identifikace infekčních agens, včetně takových, která jsou obtížně kultivovatelná, rostoucí v biofilmech, na terénu imunokompromitovaných osob (Chuang, 2006; Khanna M, 2005). Aktuální dostupná data prokazují významně vyšší senzitivitu ve srovnání se standardními mikrobiologickými metodami.

Parametry charakterizující funkční stav imunitního systému

Humorální imunita

Jednou ze základních součástí humorální imunity jsou protilátky – imunoglobuliny. Snížená koncentrace IgG, IgA a IgM byla zjištěna u pacientů s traumatem a po elektivních chirurgických výkonech (Grob, 1988; Mc Ritchie, 1990). U pacientů s popáleninami byla prokázána snížená produkce imunoglobulinů společně se sníženou odpovědí na mitogeny (Moran, Monster, 1987). Snížená koncentrace protilátek a složek komplementu společně s dysfunkcí polymorfonukleárních neutrofilů (poruchami chemotaxe, adhezí, fagocytózou i intracelulárním zabíjením) se vyskytuje u pacientů po chirurgických zákrocích, traumatu nebo s popáleninami (Christou, Hellado, 1989; Inoue, 1992). Neexistují „referenční“ hodnoty  imunoglobulinů a komplementu pro diagnózu sepse. Nicméně platí, že jejich absolutní hodnoty a dynamika představují velice užitečný a jednoduchý nástroj k posouzení stavu humorální imunity. Od roku 1999 do roku 2007 jsme provedli asi 5 000 vyšetření koncentrace imunoglobulinů u pacientů s diagnózou SIRS nebo sepse. Výskyt hypogamaglobulinémie IgG jsme prokázali v patnácti procentech případů (nepublikovaná data). Snížení složek komplementu je typické pro excesivní průběh hyperzánětlivé odpovědi a charakterizuje úklidovou reakci makroorganismu na podněty infekčního i neinfekčního charakteru. Snížená koncentrace imunoglobulinů bezesporu představuje významný rizikový faktor u pacienta s rozvinutou sepsí a je indikací k terapeutickému použití intravenózních imunoglobulinů.

Buněčná imunita

Exprese MHC znaků II. třídy na monocytech hraje důležitou roli při imunoregulačních procesech (Janeway et al., 1984). Nízká exprese antigenu HLA-DR na monocytech (CD14+ buňkách) je znakem tzv. imunoparalýzy a prediktorem nepříznivého klinického průběhu sepse (Průcha M, 2003).

Terapie sepse s využitím poznatků imunopatogeneze

Během uplynulých dvou desetiletí proběhla u pacientů se sepsí řada klinických studií s použitím imunomodulační léčby. Jejich strategie vycházela z několika následujících poznatků. Hyperzánětlivé odpovědi, při níž se v terapii uplatňují látky inhibující zánětlivou aktivitu. Příkladem jsou studie s použitím inhibitorů pro jednotlivé cytokiny TNFα a IL-1 (Reinhart, 2001), nebo s potenciálem ovlivnit průběh zánětlivé odpovědi ve smyslu její inhibice – antagonisté faktoru aktivujícího destičky (Opal, 2004), bradykininu (Fein, 1997) nebo inhibitorů cyklooxygenázy (Bernard, 1997). Naproti tomu z koncepce imunoparalýzy – tedy z využití imunostimulační terapie – vycházely studie s použitím růstového faktoru typu GM-CSF nebo interferonu gama (Nierhaus, 2003). Samostatnou kapitolou je použití intravenózních imunoglobulinů, kde je nutno zdůraznit návaznost dané léčby na průkaz hypogamaglobulinémie. V menších klinických studiích se zkoušely terapeutické přístupy s blokací působení složek komplementového systému. S nárůstem poznatků molekulární biologie o imunopatogenezi sepse se realizují přístupy s blokací receptorů toll-like nebo endotoxinu.

V současné době probíhají klinické studie s použitím polyklonálních protilátek vůči TNFα,  nebo inhibicí TLR. Širší uplatnění imunomodulační terapie v klinických studiích však zatím selhává. Diskuse o příčinách je nad rámec článku. Pouze rekombinantní protein C s částečným protizánětlivým mechanismem působení můžeme zařadit mezi imunomodulační léčbu sepse, která našla uplatnění v klinické praxi. V poslední době se však diskutuje i o účinnosti této terapie (Costa, 2007).

Závěr

Přes významný pokrok v objasnění patogeneze sepse v posledních dvaceti letech zůstává mortalita příliš vysoká. Významnou roli hraje právě dysregulace imunologických mechanismů. Jen dokonalé poznání pategeneze, používání diagnostických markerů, které dokážou dostatečně rychle a spolehlivě detekovat přítomnost infekce a zhodnotit stav imunologické surveillance makroorganismu (tedy  robustní diagnostika), umožní včasnější a účinnější imunoterapii sepse.

Zdroj: