Od komárů k lidským transplantacím

Transplantace orgánů v humánní medicíně budou mít za sebou letos už pětapadesátiletou historii. První klinický přenos ledviny se uskutečnil v roce 1954, první pokusy o transplantace plic a jater se odehrály shodně v roce 1963, pankreas byl poprvé transplantován v roce 1966 a v roce 1967 upoutal pozornost celého světa ke Kapskému Městu přenos srdce uskutečněný prof. Christianem Barnardem.

Nicméně skutečné dějiny úspěšných transplantací začaly de facto teprve v roce 1976, respektive 1978. První datum označuje rok, kdy v laboratořích firmy Sandoz (nepleťte si s dnešní generickou firmou Sandoz, tehdy šlo o jednu z velkých švýcarských společností, z níž pak sloučením s firmou Ciba Geigy vznikl dnešní Novartis) získal tým vedený prof. J. Borelem látku s velmi silným imunosupresivním účinkem – teprve ta umožnila úspěšně překonávat soutěsku mezi Scyllou rejekcí a Charybdou infekcí v bezprostředním i dlouhodobém průběhu po transplantacích. Látka byla izolována na přelomu let 1969 a 1970 ze vzorků půdy z náhorní roviny Hardanger Vidda v jižním Norsku a z amerického Wisconsinu a nazvána cyklosporin A (firemní název je Sandimmun).

Druhé datum (1978) označuje rok, kdy už byla připravena ke klinickému využití a jako první ji použil R. Y. Calne při transplantacích ledvin. Cyklosporin je peptid působící specificky na lymfocyty T, jež se podílejí na odmítavé reakci organismu vůči transplantátu, a naopak se nedotýkající lymfocytů B, které se podílejí na obraně organismu proti infekci. Do té doby se užívalo jen clony kortikoidů, které sice oklamaly imunitní systém v identifikaci transplantovaného orgánu, ale také jej zbavovaly schopnosti bránit se infekci. A tak zavedení cyklosporinu do transplantologické praxe znamenalo zcela zásadní zlepšení jejich krátkodobých a dlouhodobých výsledků, především významný pokles počtu rejekcí a významné prodloužení přežívání pacientů.

Teď si možná říkáte, že to jsou notoricky známá fakta a že zajímavé na nich může být snad jen připomenutí dat a časových souvislostí. Doufám ale, že za chvíli změníte názor. Protože o tom, že jen pár let po švýcarském cyklosporinu byl získán i cyklosporin český, ví opravdu jen málokdo.

Začalo to u komárů

O téhle zajímavé a málo známé historii MT měla možnost hovořit s RNDr. Jaroslavem Weiserem, DrSc., který kdysi jako pracovník oddělení patologie hmyzu Entomologického ústavu tehdejší ČSAV v Českých Budějovicích právě tuto látku objevil. Jak k tomu došlo? Co má patologie hmyzu a entomologie společného s transplantacemi lidských orgánů? Proč se při existenci jednoho cyklosporinu vyvíjel další? Odpovědi na tyto a další otázky se pokusíme přinést na následujících řádcích.

Dr. Weiser byl v sedmdesátých letech minulého století na základě svých předchozích vědeckých výsledků pozván k účasti na speciálním programu Světové zdravotnické organizace (WHO), Rozvojového programu OSN a Světové banky na boj s tropickými nemocemi. Zájem se soustřeďoval na malárii, spavou nemoc, onchocerkózy a také na biologický boj s přenašeči nákazy. Tuto skupinu nazvanou „Biologie a kontrola přenašečských vektorů“ prosadil právě dr. Weiser spolu s prof. J. Briggsem už v roce 1974 a fungovala až do konce let osmdesátých. Vedení tohoto „steering committee“, v němž dr. Weiser po celá ta léta pracoval spolu s řadou dalších odborníků ze všech koutů světa, se scházelo dvakrát ročně, aby posuzovalo návrhy projektů aplikace biologických faktorů proti přenašečům nákaz a rozhodovalo o jejich financování. Tehdy bylo zahájeno využívání bakterií Bacillus thuringiensis a Bacillus sphaericus, ale skupina též iniciovala použití houbiček rodu Coelomomyces proti komárům líhnoucím se ve znečištěných vodách. Dr. Weiser zde vedle odborníků z Indie, Ghany, tropické Afriky a USA reprezentoval Evropu. A jeho oddělení patologie hmyzu navíc – opět díky předchozím dobrým výsledkům – dostalo jako spolupracující centrum WHO za úkol identifikovat jednotlivé organismy napadající studované faktory.

A právě k takové identifikaci přivezl v říjnu roku 1979 jeden ze členů Steering Committee – dr. J. Pillai z Mikrobiologického ústavu University Otago v Dunedinu na Novém Zélandu – jakousi podivnou bílou houbičku. A k tomu informaci, že právě tato houbička napadá a usmrcuje komáry Adres australis v tůních na Quoin Point, asi 30 mil na jih od Dunedinu, na pobřeží poloostrova Otago na Jižním ostrově Nového Zélandu.

Vlákna téhle houbičky vyplňovala celé tělo larvy, ta zůstala viset na hladině a kolem její dýchací trubice se na vzduchu vytvářel kruhový bílý ostrůvek houbových vláken, pokrytých tlustou vrstvou konidií. „Dr. Pillai izoloval houbu na pevné médium, předal nám ji a my jsme požádali o její určení dr. Olgu Fassatiovou, která tehdy pracovala v Botanickém ústavu Karlovy univerzity,“ říká dr. Weiser a dodává: „A nastalo první překvapení – dr. Fassatiová houbu určila jako Tolypocladium cylindrosporum a sdělila nám, že tato houba se vyskytuje i v půdních vzorcích z několika málo míst v tehdejším Československu. Např. z horské lokality Čertovice v Nízkých Tatrách.“

Protože úkolem Weiserovy skupiny bylo hledat biologické faktory použitelné v boji, byla pro ně pochopitelně vlastnost houby usmrcovat komáry zajímavá sama o sobě. Jenže bylo tu ještě něco navíc. Tolypocladium patří k tzv. deuteromycetám, které obecně napadají hmyz tak, že se na něj nalepí, proniknou pokožkou a svým růstem pak postiženého jedince zničí. Tohle se ovšem špatně uplatní u vodních organismů, a tady vstupuje na scénu druhá výjimečná vlastnost Tolypocladia – jako jediná deuteromyceta dokáže komára infikovat i perorálně! Larvy komárů totiž filtrují v sítkách svého ústního ústrojí kromě bakterií z vody i konidia houby, ta pak vyklíčí v jejich střevě a proniká do tělní dutiny, kterou pak spletí hyf vyplní a tak larvu usmrtí.

Dr. Weiser v tom spatřoval velkou šanci na aktivní využití houby jako prostředku proti larvám komárů. Stačilo by přenést houbu z kultivační půdy do jarních tůní a…

Neukázněná studentka aneb náhoda přeje připraveným

Weiserův tým se pustil do práce. K testování měli k dispozici již z dřívějška dobrou metodu s použitím chovů komárů Culex pipiens autogenicus – to jsou ti, kteří v nemocnicích či ubytovnách vylétají z poklopů zatopených kanálů s ústředním topením a způsobují svým bodáním utrpení nehybným nemocným. Tyto komáry je možné kontinuálně chovat v laboratoři a jejich larvy se vyživí na kůrce chleba tak, že jako dospělí vydrží i velmi dlouho bez krve. A jejich larvy jsou k dispozici stále.

Pokusy v malých miskách potvrdily, že larvy se konidiemi přidanými do vody skutečně infikují a že v důsledku toho během pěti dnů umírají.

Dr. Weiser sehnal i dalších sedm druhů rodu Tolypocladium a rozhodl se zjišťovat, který z nich by mohl být ve svém „komárobijectví“ nejúčinnější. V lednici měl krabice stárnoucích, ale krásně narostlých šikmých agarů s jednotlivými kmeny a jednou za měsíc to vše prohlížel a přeočkovával na nové „šikmouše“. A k tomu navíc pečoval o komáry určené k likvidaci – dával jim krev a přenášel snůšky vajec do talířů s vodou a kůrkou chleba.

Někdy koncem tohoto rušného roku 1979 se v laboratoři objevila studentka, která hledala téma diplomové práce, a dr. Weiser jí nabídl právě srovnávání patogenity jednotlivých kmenů Tolypocladií. Prostudovala základní literaturu, napěstovala kmeny na šikmých agarech a nalila na ně sterilní vodu, aby spláchla konidie. Pak ale přelité šikmouše nechala ve stojánku v lednici a odjela domů na Vánoce. A odečítání mortality v miskách po 24, 48 a 72 hodinách a po pěti dnech zůstalo o svátcích na dr. Weiserovi. Podařilo se mu prokázat nejen to, že některé kmeny jsou aktivnější než jiné, ale i to, že houba zabíjela vzorně nejen komáry Culex pipiens autogenicus, ale i komáry Adres aegypti a Anopheles. Byl to dobrý materiál pro další vývoj.

Když ale dr. Weiser otevřel ledničku znovu po Novém roce 1980 a spatřil tam stále ještě stojánek se zatopenými šikmými agary, přišlo mu líto materiál vyhodit. A tak znovu zopakoval předchozí pokus a připravil tři ředění každé suspenze. Pak přidal komáry a počítal s tím, že odečte konečnou mortalitu po pěti dnech.

Jenže při prohlížení misek druhý den zjistil, že vše je jinak. Nacházel mrtvé larvy již po dvaceti hodinách, navíc podivně srpkovitě zkroucené. To musel být účinek toxinu!

Na chvíli podlehl dr. Weiser obavě, že se tam nějak dostal Bacillus thuringiensis – s ním ale už delší dobu nepracoval. Tak suspenzi povařil a sterilizoval, poté odstředil a pracoval jen s čirou tekutinou. Prohnal ji také milipórovým filtrem. Nicméně čirá a přefiltrovaná tekutina byla aktivní nadále a usmrcovala komáry během čtyřiadvaceti hodin.

Co se to vlastně stalo? Během uložení v lednici se z vysporulované kultury do vody zálivky musela vyloučit nějaká ve vodě rozpustná látka, která je schopna odolat vyschnutí i varu a sterilizaci v Kochově hrnci. A ta látka se musela vyluhovat z agaru ve starých kulturách – samotné šikmé Sabouraudovy agary byly neaktivní.

Bylo tedy třeba získat dostatečné množství suché aktivní látky v čisté podobě, aby ji bylo možno určit. Byla zima a v laboratoři hřála akumulační kamna. Nejjednodušší tedy bylo naočkovat houbu na velké misky, nechat ji narůst, pak půdu sterilně vyloužit a nechat ji na kamnech vysušit. Tak se také stalo a dr. Weiser získal nahnědlou látku, která měla na komáry stejně toxické účinky jako původní vzorek. Nazval ji – podle původce Tolypocladia – Tolypin.

Od Tolypinu k cyklosporinu

Začátkem roku 1980 měl tedy dr. Weiser řadu kmenů houby Tolypocladium a v rukou nově objevený aktivní metabolit této houby, zbývalo vyčistit a určit onu aktivní látku. Jenže právě v té době se bohužel v ústavu na Flemingově náměstí chystaly změny. Akademie se rozhodla Weiserovu laboratoř vystěhovat a v jejích prostorách umístit stavební dozor pro chystanou výstavbu nové velké budovy pro molekulární genetiku. Část laboratoře byla přesunuta do Českých Budějovic a dr. Weiser se musel v Dejvicích přestěhovat do sklepa protilehlého rohového domu s okny u samého stropu. Jak se říká, když se kácí les, lítají třísky, a koho tehdy zajímali nějací komáři? K zajištění dalšího moderního vývoje laboratoře přijal tehdy dr. Weiser do její českobudějovické části biochemika ing. V. Maťhu a organického chemika dr. A. Jegorova a právě s nimi se věnoval i charakterizaci Tolypinu.

Někdy v roce 1986 pak dr. Weiser nalezl v Current Contents zprávu firmy Sandoz, že houba užívaná při výrobě cyklosporinu A není Trichoderma polysporum, jak bylo (omylem či záměrně?) uvedeno v patentovém spisu, nýbrž houba Tolypocladium. Čili tatáž houba, kterou přivezl z Nového Zélandu doktor Pillai a kterou teď pěstoval dr. Weiser. Divíte se, že to v jeho hlavě okamžitě generovalo otázku, zda jeho toxin Tolypin není vlastně cyklosporin?

Není cyklosporin jako cyklosporin

Bylo štěstí, že firma Sandoz poskytla našemu týmu malý vzorek čistého cyklosporinu A a bylo tedy možno začít srovnávat. Ukázalo se, že švýcarský cyklosporin je cyklický polypeptid jen málo rozpustný ve vodě a že jde o endotoxin, který zůstává uzavřen v hyfách a konidiích v nitru buněk houby a z kultury ho lze izolovat pouze vytřepáním do organického rozpustidla. Naopak látka označovaná dosud jako Tolypin byla exotoxinem, který se uvolňoval do prostředí samovolně při kultivaci. Jinak ale bylo zřejmé, že jde o totožné látky, respektive že cyklosporin získaný Weiserovou skupinou je generikem cyklosporinu produkovaného v Basileji.

Pracovníci Sandozu se při svém postupu výroby s tímto exotoxinem vůbec nesetkali; vytváří se pravděpodobně jen při určitém typu kultivace při nízkých teplotách a jen u některých kmenů.

Byl tedy k dispozici produkční kmen (nakonec se jako nejvýhodnější ukázal kmen Tolypocladium niveum), nový postup fermentace a izolace (metodu vypracovala – původně pro stacionární fermentaci námele – skupina dr. Kybala, protože však při fermentaci se půdy ohřívají a námel při vyšších teplotách špatně fermentoval a neprodukoval alkaloidy, bylo zařízení k dispozici pro jiné účely), a tak se český tým v roce 1987 rozhodl pokusit se, ve spolupráci s tehdejším národním podnikem Galena, o uplatnění vlastního patentu na výrobu českého cyklosporinu A.

Neúspěch je vždy sirotek, úspěch má desítky otců

Weiserův tým mohl očekávat nejen patent, ale i morální a materiální ocenění. To by ovšem nesměli žít v Československu konce osmdesátých let, ovládaném tehdy ještě všemocnou KSČ. Stranický aparát stopl proces patentování a začal „přeobsazovat pozice“. Dr. Weiser jako nestraník byl odsunut do pozadí, musel dokonce opustit i onen sklep na Flemingově náměstí a hledat útočiště ve svém mateřském oddělení na parazitologii. Do popředí se začali drát jiní, „zasloužilejší“. Jen se nejdříve museli naučit vyslovovat to zatraceně složité slovo „tipokladium“. Jiní stále nechtěli pochopit, jak nějací entomologové, následovníci pana Paganela z verneovky Děti kapitána Granta, chytají cyklosporin do síťky na motýly. Jen mezinárodní prověřovací komise tak potvrdila originálost českého postupu a jimi získané látky.

Pak přišla sametová revoluce a stranické šuplíky, které skrývaly žádost o patent, zmizely. Weiserův tým dostal šanci dokončit patentní řízení sám a zavést výrobu českého cyklosporinu A v závodě firmy Galena v Kunčicích. To se skutečně podařilo, když Galena vyvinula originální postup výroby substance i vlastní lékovou formu a dala tak klinické praxi účinný a bezpečný lék.

Jenže vědecké vedení ústavu ČSAV právě v té době zjistilo, že projekt týkající se cyklosporinu už nemá co dělat s entomologií, oba Weiserovi spolupracovníci byli propuštěni a oddělení patologie hmyzu bylo zrušeno. Entomologové se přece mají věnovat chytání poletujícího hmyzu do sítěk či na lepové pásy.

Souhra náhod a tvrdé práce

Navzdory neobyčejně rychlému pokroku v oblasti imunosuprese a zavedení celé řady nových imunosupresiv v posledních letech zůstává cyklosporin A jedním ze základních kamenů imunosupresivní léčby pacientů po transplantacích. A to jak v podobě originálního přípravku Sandimmun, tak v podobě původního českého přípravku označovaného původně firemním názvem Consupren a nyní (poté, co se někdejší Galena přeměnila na Ivax a poté se stala součástí dnešní největší generické společnosti světa – Teva) názvem Equoral.

Vzhledem ke svému převratnému významu pro úspěšnost transplantací je někdy objev cyklosporinu přirovnáván dokonce k objevu penicilinu. Navíc nelze opomenout, že kromě transplantací se cyklosporin A stále více uplatňuje i při léčbě autoimunitních onemocnění, zkoušejí se i některé další klinické aplikace, intenzivní studium mechanismu jeho působení na celulární a subcelulární úrovni přispívá i k rozšiřování teoretických znalostí v oblasti aktivace lymfocytů T a regulace imunitní odpovědi na molekulární úrovni.

Proto docela určitě stojí za to připomenout i výsledek souhry náhod, schopností jich využít a cílevědomé tvrdé práce několika českých výzkumníků, kteří se na tomto významném kroku na cestě k úspěšnějším transplantacím podíleli.

Zdroj: