Technologie mRNA a jejich využití

Terapeutika založená na technologii mRNA byla až donedávna pouze předmětem vědeckého vývoje. S příchodem covidové krize se nicméně dostala do popředí zájmu a předpokládá se, že úspěch vakcín Comirnaty a Spikevax usnadní vstup na trh celé řadě dalších produktů. Nejedná se přitom jenom o vakcíny v úzkém slova smyslu, které chrání zdravé osoby před infekcí. „Využívat se budou pravděpodobně v mnoha indikacích, od vakcín proti infekci přes léčbu nádorových onemocnění až po terapii autoimunitních chorob. Své místo mohou najít všude tam, kde je třeba spustit odpověď imunitního systému proti definovanému antigenu, a zvažováno je také použití vakcín, které budou přímo v organismu vyrábět monoklonální protilátky. Po úspěchu vakcín proti SARS‑CoV‑2 se již nyní vyvíjejí mRNA vakcíny proti dalším infekčním agens, včetně viru HIV, cytomegaloviru, viru ziky, eboly, vztekliny a dále třeba proti malárii nebo toxoplasmě gondii,“ uvedl MUDr. Aleš Kmínek, MBA, na letošním webináři z cyklu Terapie budoucnosti, který pořádala Česká lékařská společnost JEP ve spolupráci s Asociací inovativního farmaceutického průmyslu.

Klasické vakcíny poskytují organismu příjemce přímo molekulární znaky, na které by se měl imunitní systém zaměřit, a to ve formě živých oslabených patogenů, inaktivovaných patogenů nebo jejich částí. Naopak při aplikaci mRNA vakcín je do těla vpraven genetický kód, podle kterého si buňky organismu cílový molekulární znak samy vytvoří. Běžně je genetická informace v buňce člověka zapsána v molekule DNA, která neopouští jádro. Aby mohl být vytvořen protein, musí se informace z DNA přepsat do molekuly mRNA (messenger RNA) v procesu zvaném transkripce. Molekula mRNA potom přejde z jádra do cytoplazmy, kde je podle ní na ribozomech v procesu zvaném translace spojena sek­ven­ce aminokyselin a vznikne protein. Vakcíny založené na mRNA technologii obsahují mRNA podobnou té tělu vlastní a pokročilé nosiče – lipidové nanočástice (LNPs). Pomocí LNPs se dostanou do cytoplazmy, kde využijí výše zmíněný ribozomový aparát a dojde k translaci jejich informace do proteinu. Zcela ovšem in vivo přeskočí fázi transkripce, nijak nevstupují do jádra a ani neinteragují s molekulou DNA. Modifikace vlastní genetické informace příjemce je tak vyloučena. Určitou výjimkou jsou sebereplikující mRNA vakcíny, které kromě molekuly mRNA obsahují virový vektor a vstupují do jádra. Jejich výhodou je nutnost vpravení minimální dávky do organismu, v buňkách se nenakopíruje jen cílový protein, ale i vlastní informace nutná k jeho tvorbě. Na této technologii ovšem v současnosti není založena žádná schválená terapeutická látka a žádná není ani ve fázi klinického testování. Nových platforem pro potenciální sofistikované vakcíny je více, ať už využívají virové vektory, DNA vakcíny, nebo virům podobné částice. Tyto technologie jsou zkoumány zejména v možnostech léčby nádorových a vzácných metabolických onemocnění.

Velkou předností mRNA vakcín je jejich relativní univerzálnost a s tím spojený rychlý vývoj modifikovaných verzí. Na rozdíl od klasických vakcín nepracují s celými živými patogeny s omezeními a riziky z toho vyplývajícími. „To se koneckonců ukázalo v koronavirové krizi, kdy od začátku pandemie do jejich schválení neuplynul ani jeden rok a naprostá většina této doby připadla na klinické zkoušení. Podle vyjádření výrobců by bylo na představení modifikované verze na mutované formy koronaviru nutné čekat jen jednotky týdnů, maximálně měsíců. Koncept vývoje nové aplikace se opírá o identifikaci cílového patogenu a následně klíčového antigenu, na který by měl imunitní systém reagovat. V případě viru SARS‑CoV‑2 je to povrchový spike protein. Následně je nutné provést sekvenaci genu pro vybraný antigen, ten syntetizovat a naklonovat do plazmidové DNA. Z plazmidové DNA se informace přepíše do mRNA. Až dosud celý proces probíhá in vitro za přísných podmínek dobré výrobní praxe (GMP) a v podstatě kopíruje přirozenou transkripci. Výsledným produktem je čistá molekula mRNA, která se zabalí do pokročilého nosiče a vpraví do těla příjemce. Následuje využití hostitelských mechanismů k tvorbě antigenu podle informace mRNA a na tomto základě dochází k navození buněčné a humorální imunitní odpovědi,“ popsal MUDr. Kmínek.

Ačkoli je v budoucnu v plánu umístit na povrch LNPs proteinovou molekulu, která by směřovala jejich zacílení do konkrétních buněk, v tuto chvíli tato možnost dostupná není. Vakcína se tak dostává náhodně do buněk v místě aplikace. Část molekul mRNA vstoupí procesem endocytózy do antigen prezentujících buněk, nejčastěji buněk dendritických. V cytoplazmě se mRNA uvolní z nosiče a podle informace v ní zapsané se translatuje protein – v případě covidových vakcín spike protein koronaviru S antigenem navázaným na molekulu MHC interagují především T‑helper CD4+ lymfocyty, které následně stimulují cytotoxické CD8+ lymfocyty a s tím spojenou buněčnou imunitu, respektive přeměnu B lymfocytů na plazmatické buňky tvořící neutralizující protilátky. B lymfocyty rovněž samostatně interagují s celým na povrchu vystaveným proteinem. Kromě toho vznikají paměťové buňky, které zajistí rychlou odpověď při dalším setkání s patogenem,“ uvedl MUDr. Kmínek a pokračoval: „mRNA vakcíny ale nemusejí kódovat jen antigen infekčního agens. Jednat se může třeba i o určitý molekulární znak buněk zhoubného nádoru, proti kterému analogicky imunitní systém zakročí. V tomto smyslu je již několik studií ve III. fázi, díky úspěchu vakcín proti SARS‑CoV‑2 lze očekávat určitou akceleraci. Zajímavá je také aplikace mRNA technologie k tvorbě monoklonálních protilátek in vivo, která je nyní pouze ve fázi testování na animálních modelech. Tímto způsobem by se dalo léčit v podstatě jakékoli onemocnění, v jehož terapii monoklonální protilátky figurují, respektive by takto šla provádět pasivní imunizace. mRNA by kódovala informaci pro monoklonální protilátku, buněčný aparát by je potom vytvořil a vzniklé protilátky by se buď navázaly na buněčný povrch, nebo by došlo k jejich sekreci do cirkulace.“

Z klinického zkoušení mRNA vakcín proti SARS‑CoV‑2 vyplývá, že nežádoucí účinky s nimi spojené nejsou příliš odlišné od nežádoucích účinků klasických vakcín a jejich bezpečnost je přinejmenším srovnatelná. Samozřejmě platí, že ani velká klinická studie nemá dostatečnou sílu pro zachycení velmi vzácných, byť i závažných nežádoucích účinků. Proto je nutná farmakovigilance v běžné klinické praxi, ani zde ale neexistují nyní žádné varovné signály. Plošné použití mRNA vakcín proti novému typu koronaviru se jeví jako výhodné nejenom z hlediska poměru ochrany a nežádoucích účinků, ale také z hlediska ekonomického. Například podle ekonomického modelu autorů Sandmann et al. z Velké Británie se ukázalo, že vakcinace přinese během příštích 10 let finanční přínos v řádu desítek až stovek miliard liber. Všechny scénáře bez vakcinace přitom vždy vedly k významným finančním ztrátám.

Lipidové nanočástice – k čemu slouží?

Molekula mRNA je velmi labilní a zejména v alkalickém prostředí snadno podléhá hydrolýze. Zároveň je in vivo degradována všudypřítomnými ri­bo­nuk­leá­za­mi, které se vyskytují nejenom uvnitř organismu, ale třeba i na povrchu pokožky. Vzhledem k tomu, že translace probíhá v cytoplazmě, musí pro správnou funkci vakcín molekula mRNA překonat buněčnou membránu. Za tímto účelem je v terapeutických aplikacích zabalena do pokročilých nosičů, kterými jsou LNPs. I přes použití LNPs musejí být zatím vakcíny dlouhodobě skladovány ve velmi nízkých teplotách. O LNPs podrobně hovořila Mgr. Klára Grantz Šašková, Ph.D., z Ústavu organické chemie a biochemie Akademie věd ČR. Dr. Grantz Šašková připomněla, že terapeutické použití RNA je širší. Kromě mRNA se v různé fázi vývoje používají její další formy, například asRNA, miRNA, siRNA nebo aptamery. Zatímco mRNA se používá k vyvolání genové exprese, některé jiné aplikace vedou buď k umlčení genové exprese, nebo mohou být dokonce použity k editaci genů na základě technologií, jako je CRISPR/Cas nebo ADARs. „Pro klinické použití na lidech je nicméně vedle mRNA vakcín proti SARS‑CoV‑2 Comirnaty a Spikevax schválena jen látka využívající siRNA patisiran. Používá se k umlčení exprese abnormálního proteinu v indikaci hereditární transthyretinové amyloidózy.“

Metoda aplikace je přitom variabilní. Dosud používané mRNA vakcíny se podávají intramuskulárně, u dalších produktů ale bude možné zvážit různé způsoby aplikace včetně subkutánního, nazálního, intratumorálního, nitrožilního nebo třeba podání do sleziny.

Dr. Grantz Šašková vysvětlila, že aby buňky organismu začaly produkovat cílový protein kódovaný mRNA, musí tato molekula co nejvíce kopírovat mRNA tělu vlastní. Klíčovou strukturou je v tomto smyslu 5´ čepička, na kterou nasedá ribozom a zahajuje translaci. Podstatný je rovněž poly‑A 3´ konec, který celou molekulu stabilizuje. „Na druhou stranu ne všechno je u syntetických mRNA shodné. V klinických aplikacích se používá například záměna uracilu za uridin, která vede k úniku rozpoznání imunitním systémem, a tím i zničení molekuly ještě před dosažením místa určení. Nejvíce ale molekulu mRNA v používaných farmakách chrání právě LNPs. Jedná se o klinicky nejpokročilejší nevirový systém pro doručování nukleových kyselin, včetně mRNA. Jejich výhodou je vysoká účinnost enkapsulace, tedy schopnost pojmout velké množství účinné látky, vysoká schopnost průniku do buněk a v neposlední řadě rovněž zanedbatelná toxicita a dobrá snášenlivost. Nelze si je ale představovat jako jednoduchou micelu s lipidovou membránou a náplní. Jedná se spíše o sofistikovanou vrstvenou solidní částici s pevným jádrem obsahujícím kromě mRNA také klíčovou složku LNPs, zodpovědnou za její unikátní vlastnosti – ionizovatelný kationický lipid. Ten kromě vazby na mRNA zajišťuje, že po vstupu endocytózou do cílové buňky dojde v jejím kyselém prostředí k rozpadu LNP a uvolnění mRNA do cytosolu. Ionizovatelný kationický lipid se v jednotlivých přípravcích liší, a právě na jeho vývoj připadá nejvíce pozornosti. Ostatní složky LNPs jsou univerzální, jako výplň mezi lipidy se používá cholesterol, pro vstup do buňky a strukturální funkci se přidává takzvaný pomocný lipid a na povrchu je PEG lipid, který celou částici stabilizuje a chrání před opsonizací. LNPs pro průmyslové použití musejí mít vysokou kvalitu ve smyslu shodných vlastností napříč jednotlivými šaržemi, jinak by jejich použití neumožňovalo konzistentní klinický výzkum. V rámci GMP se sleduje míra zapouzdření mRNA, velikost částic, jejich čistota a další vlastnosti,“ popsala.

Na vývoji LNPs nové generace se podílí také Dr. Grantz Šašková a její kolegové. Jako ionizovatelný kationický lipid využívají patentovaný ionizovatelný lipidoid na bázi adamantanového jádra, označovány jsou jako XMANs. Vyznačují se univerzalitou pro zapouzdření jakékoli nukleové kyseliny, vysokou schopností penetrace a dlouhodobou stabilitou i při 4 °C, tedy v prostředí normální lednice, nikoli supermrazáku. „Tyto částice se sestavují pomocí mikrofluidního čipu ve tvaru písmene Y. Jedním ramenem se přivádí lipidická část, druhým nukleová kyselina a pomocí mikrofluidního míchání jsou obě složky kombinovány. Z posledního ramene je odebírán cílový produkt. Tento způsob výroby je poměrně obtížné zajistit zejména ve velké kapacitě, ale i zde dochází k rychlému pokroku. Nové LNPs je třeba podrobit intenzivní kontrole kvality. Jednou z možností je například zakódovat do mRNA zapouzdřené v LNPs fluorescenční protein a vytvořený produkt smíchat s tkáňovou kulturou, ať už univerzální, nebo třeba s izolovanými primárními buňkami od konkrétního pacienta. Následně se sleduje, zda a kdy dochází k produkci fluorescenčně detekovaného proteinu. U XMANs se daří dosáhnout vyšší pozitivity fluo­res­cen­ční aktivity buněk a její vyšší intenzity ve srovnání s doručením mRNA konvenčními LNPs. Analogicky lze LNPs testovat in vivo pomocí bioluminiscenčního proteinu a jeho rozpoznáváním v těle animálního modelu pomocí speciálního čidla,“ dodala.